在生物打印技術(shù)中，壓電噴墨（Inkjet）生物打印最適合重建薄而復(fù)雜的軟組織特征。因?yàn)槠浒葱璐蛴》椒ň哂蟹直媛矢?、印刷速度快、高?xì)胞活性、材料浪費(fèi)低等優(yōu)勢?；趪娔纳锎蛴C(jī)可噴射典型體積為1~100pL的微液滴（MicroFab的Inkjet噴墨技術(shù)可實(shí)現(xiàn)≥0.1pL的微液滴），可對活的哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行微圖案化。

隨著新呼吸道病毒的爆發(fā)和肺部疾病的高死亡率，迫切需要人類呼吸系統(tǒng)的生理相關(guān)模型來研究疾病發(fā)病機(jī)制、藥物療效和藥理學(xué)。生物打印技術(shù)是可用于制造復(fù)雜結(jié)構(gòu)的*D組織模型的新興技術(shù)之一。生物打印可以*D方式自動沉積細(xì)胞和生物材料，實(shí)現(xiàn)組織模型的高度控制和定制生產(chǎn)。生物打印組織工程可以為體外藥物篩選和毒性研究提供更精確的模型。在生物打印技術(shù)中，壓電噴墨生物打印最適合重建薄而復(fù)雜的軟組織特征。這是因?yàn)榘葱璐蛴》椒ň哂蟹直媛矢摺⒋蛴∷俣瓤?、高?xì)胞活性、材料浪費(fèi)低等生物打印技術(shù)的優(yōu)勢?；趪娔纳锎蛴C(jī)在其噴頭中包括一個壓電制動器，在電脈沖下在墨水腔內(nèi)產(chǎn)生聲波，以噴射典型體積為 1~100 pL（10-12L）的非常小的液滴（MicroFab噴墨技術(shù)可實(shí)現(xiàn)≥0.1pL的微液滴），噴墨打印的這種能力已被證明能夠在2D和*D環(huán)境中以高精度和速度對活的哺乳動物細(xì)胞進(jìn)行微圖案化。

浦項(xiàng)科技大學(xué)相關(guān)研發(fā)團(tuán)隊(duì)在“All-Inkjet-Printed *D Alveolar Barrier Model with Physiologically Relevant Microarchitecture”（發(fā)表于《Advanced Science》）報告了一個全噴墨打印的肺泡屏障模型，其具有上皮和內(nèi)皮的功能層，中間有膠原基底膜。四種類型的人類肺泡細(xì)胞的高分辨率圖案，即NCI-H1*0*（肺上皮I型細(xì)胞）、NCI-H441（肺上皮II型細(xì)胞）、HULEC-*a（肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞）和MRC*（肺成纖維細(xì)胞）以及I型膠原蛋白，通過按需噴墨打印自動高分辨率沉積肺泡細(xì)胞，能夠制造出厚度達(dá)到前所未有的≈10μm的三層肺泡屏障模型。結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)模型相比，*D結(jié)構(gòu)模型更好地再現(xiàn)了肺組織的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能，而且與肺泡細(xì)胞和膠原蛋白均勻混合的*D非結(jié)構(gòu)模型相比，*D結(jié)構(gòu)模型更好地再現(xiàn)了肺組織的結(jié)構(gòu)、形態(tài)和功能。按需應(yīng)變噴墨打印技術(shù)是一種實(shí)現(xiàn)個性化、可擴(kuò)展制造、尺寸和生長標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)，相信這種*D肺泡屏障模型可以作為病理學(xué)和制藥學(xué)應(yīng)用中傳統(tǒng)測試模型的替代方法。

肺泡屏障模型的噴墨生物打印

▲ 圖1 肺泡屏障模型的制作

圖1a）鬼筆環(huán)肽染色的人肺泡細(xì)胞系的共聚焦熒光顯微鏡圖像。肌動蛋白呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。比例尺：*0μm。b）制作肺泡屏障模型的噴墨打印工藝示意圖。所有細(xì)胞均采用噴墨打印，逐層打印。此圖像是使用BioRender創(chuàng)建的。

圖1顯示了肺泡細(xì)胞系的類型和用于制造超薄三層肺泡屏障模型的噴墨打印工藝。以人肺細(xì)胞系NCI-H1*0*為扁平鱗狀上皮AT I，NCI-H441為立方形AT II，內(nèi)皮細(xì)胞 HULEC-*a和MRC*為成纖維細(xì)胞。圖1a中的共聚焦熒光顯微鏡圖像顯示了每種細(xì)胞類型的形態(tài)。通過這些細(xì)胞和膠原蛋白的精確噴墨打印完成了薄的三層肺泡屏障模型的制作（圖1b）。在transwel滲透性支持物中，內(nèi)皮細(xì)胞墨水、膠原蛋白墨水和含有成纖維細(xì)胞的膠原蛋白墨水以逐層方式依次打印。內(nèi)皮細(xì)胞墨水首先噴墨打印到transwel插入物的多孔膜上。孵育24小時后，將膠原蛋白和載有成纖維細(xì)胞的膠原蛋白墨水印在內(nèi)皮層的頂部。在培養(yǎng)箱中將膠原蛋白完全交聯(lián)24小時后，將數(shù)量為1:2的AT I和AT II上皮細(xì)胞均勻地沉積在下層。除膠原基油墨在4°c的溫度下印刷以防止其在噴射過程中發(fā)生交聯(lián)外，其余印刷過程均在室溫下進(jìn)行。采用全噴墨打印的肺泡模型，將肺泡上皮暴露于空氣中培養(yǎng)14天，并對其結(jié)構(gòu)和生理功能進(jìn)行進(jìn)一步評價和分析。

噴墨細(xì)胞打印工藝優(yōu)化

首先，課題組為每種細(xì)胞類型開發(fā)了可靠的噴墨工藝。NCI-H1*0*、NCI-H441和HULEC-*a細(xì)胞的生物油墨水在細(xì)胞生長介質(zhì)中制備，MRC*細(xì)胞被懸浮在稀釋的膠原蛋白墨水中。圖2a顯示了生物墨水的單閃光噴射圖像。所有的生物墨水都用80μm大小的壓電噴嘴噴射出來，噴射速度為*ms-1。精確調(diào)整的雙極演化波形和氣動壓力使細(xì)胞液滴具有高分辨率和穩(wěn)定性的模式。在所有的實(shí)驗(yàn)中，其上升、下降和停留時間被設(shè)定在10μs左右，峰值驅(qū)動電壓為±80V。

▲ 圖2 優(yōu)化噴墨生物打印參數(shù)

圖2 a）用直徑為80μm的壓電噴嘴對人體肺泡細(xì)胞進(jìn)行噴墨打印的單閃光圖像。比例尺：100μm。b）代表圖像，8×8個細(xì)胞液滴陣列印在玻璃基板上，間距為*00μm。小圖：放大2×2陣列。c） *2×*2陣列中每個液滴的平均細(xì)胞數(shù)。

接下來，課題組檢查了單個pL級液滴中的打印細(xì)胞數(shù)量，以控制沉積在每層肺泡組織上的細(xì)胞的準(zhǔn)確數(shù)目。為此，研究人員在玻璃基板上打印了*2×*2液滴陣列，每種細(xì)胞類型的濃度為*×106和6×106個細(xì)胞mL-1。圖2b顯示了具有代表性的8×8打印細(xì)胞圖像。在圖2c中，顯示了每種細(xì)胞類型的用一滴彈出的平均細(xì)胞數(shù) 。在放大的2×2陣列圖像中，細(xì)胞生長培養(yǎng)基墨滴中的細(xì)胞比膠原蛋白墨水少。在計(jì)算每個液滴上平均攜帶的細(xì)胞數(shù)量（圖2c）時，課題組發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞生長培養(yǎng)基墨水中的濃度為6×106個細(xì)胞mL-1時，大約有一個細(xì)胞被打印在液滴中。對于稀釋的膠原蛋白墨水，以*×106個細(xì)胞mL-1的濃度打印單個細(xì)胞。課題組根據(jù)這些條件確定了每種細(xì)胞墨水的濃度，以制造分辨率高、精度高的*D肺泡模型。

噴墨打印細(xì)胞的可行性評估

為了研究通過微米大小的噴頭噴射對細(xì)胞活力和增殖的任何潛在影響，課題組在打印后立即進(jìn)行了LIVE/DEAD檢測和*天的CCK-8檢測。圖*a顯示了通過分析染色鈣黃綠素乙酰氧基甲酯（綠色、活細(xì)胞）和溴乙啡錠二聚體1（紅色、死細(xì)胞）的細(xì)胞群而獲得的細(xì)胞活力。結(jié)果表明，打印組的細(xì)胞存活率高達(dá)*0%，接近手動移液對照組的值。在這項(xiàng)研究中，所有人類細(xì)胞類型的存活率都很高。圖*b顯示了打印和對照組在一周內(nèi)每個細(xì)胞系的增殖率。在實(shí)驗(yàn)中，打印細(xì)胞組跟隨著移液器對照組的生長趨勢，沒有觀察到任何明顯的細(xì)胞死亡，表明噴墨生物打印對正在使用的肺泡細(xì)胞沒有不利影響。

▲ 圖* 打印后細(xì)胞生存能力測試

圖*a）執(zhí)行LIVE/DEAD檢測，以確定打印后細(xì)胞的可行性（n=*）。b）執(zhí)行CCK-8檢測以評估打印后*天的細(xì)胞增殖（n=*）。

噴墨生物打印系統(tǒng)

使用基于壓電打印方法的按需噴墨（DoD）噴墨生物打印系統(tǒng)（Jetlab?Ⅱ; MicroFab, TX, USA），生物墨水以液滴形式噴射，包括x-y直線電機(jī)和一個±2μm高分辨率的z軸（噴頭沿z軸移動）。采用80μm直徑的噴墨打印噴頭（MJ-ATP-01-80; MicroFab）。系統(tǒng)中的儲墨器和噴嘴的溫度由一個帶有冷凍循環(huán)槽的集成冷卻系統(tǒng)精心控制。與電壓施加相關(guān)的參數(shù)被調(diào)整以控制液滴的大小和直線度。通過±80V的JetDrive?控制器（MicroFab）給壓電元件施加雙極性電壓波形，其上升、停頓和下降時間分別為≈10μs。將液滴速度調(diào)整到*ms-1。x-y運(yùn)動平臺的速度和加速度分別為1*mms-1和*00mms-2。單元陣列和模式是從單色位圖圖像中打印出來的。通過控制打印液滴的數(shù)量、生物墨水的細(xì)胞濃度以及液滴之間的距離，可以調(diào)整要打印的細(xì)胞數(shù)量。為了防止細(xì)胞在打印過程中沉淀，每隔10分鐘移液一次重新懸浮充滿細(xì)胞的墨水。

參考文獻(xiàn)：

[1] Kang D , Ju A P , Kim W , et al. All‐Inkjet‐Printed *D Alveolar Barrier Model with Physiologically Relevant Microarchitecture[J]. Advanced Science, 2021.